공개 데이터 분석

SARS-CoV-2 계통에 대한 데이터와 칠레에서 사용 가능한 서열에서 샘플을 채취한 날짜는 다음 사이트에서 사용 가능한 Consorcio Genomas CoV2 사이트에서 가져왔습니다. https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. 예방접종 데이터는 과학기술지식혁신부 공개 데이터에서 얻었습니다. https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (제품 83).

감염성 분석

다른 SARS-CoV-2 스파이크 단백질을 운반하는 의사형 바이러스는 이전에 설명한 대로 준비되었습니다.¹². 간단히 말해서, HIV-1 기반 SARS-CoV-2 유사형은 pNL293-ΔEnv-Luc를 상응하는 pCDNA-SARS-CoV-4.3 스파이크 코딩 벡터와 함께 2:1 몰 비율로 형질감염시켜 HEK1T 세포에서 생성되었습니다. 소포체에서의 체류를 피하는 것으로 알려진 C-말단 말단(SΔ19)의 마지막 19개 아미노산이 결여된 코돈 최적화 스파이크를 코딩하는 플라스미드¹² 유전자 합성 또는 맞춤형 부위 지향적 돌연변이유발(GeneScript)에 의해 얻었고 다음 돌연변이를 포함했습니다: 계통 A(참조 서열), 계통 B(D614G), 계통 B.1.1.7(Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), 계보 P.1(L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, 1027-37G, H75Y, T76) 및 T246 계통 252, L452Q, F490S, D614G, T859N). 각 유사형 제제는 실온에서 3,000 rpm에서 원심분리하여 제거하고 HIV-1 Gag p24 Quantikine ELISA 키트(R&D Systems)를 사용하여 정량화하고 50% 소 태아 혈청(Sigma-Aldrich)에 분취하고 -80°C에서 다음까지 보관합니다. 사용. 다른 양의 유사형 바이러스(HIV-1 p24 단백질 수준에 따라 결정됨)를 사용하여 HEK-ACE2 세포를 감염시키고 48시간 후 Glomax 96 Microplate에서 Luciferase Assay Reagent(Promega)를 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정했습니다. 광도계(Promega).

중화 분석

의사형 바이러스 중화 분석은 우리가 이전에 설명한 대로 본질적으로 수행되었습니다.¹². 간단히 말해서, 혈장 샘플의 연속 희석액(1:4 ~ 1:8748)을 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM에서 제조하고 5°C에서 24시간 동안 1ng의 p37 p1와 인큐베이션한 다음 10xXNUMX⁴ 의 HEK-ACE2 세포를 각 웰에 첨가하였다. 유사형 바이러스(계통 A)와 함께 배양된 HEK293T 세포(ACE2를 발현하지 않음)를 음성 대조군으로 사용하였다. 48시간 후 세포를 용해하고 Glomax 96 Microplate luminometer(Promega)에서 Luciferase Assay Reagent(Promega)를 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 각 희석액에 대한 중화 백분율을 계산하고 GraphPad Prism 버전 50을 사용하여 각 샘플의 ID9.0.1을 계산했습니다.

통계 분석

GraphPad Prism 소프트웨어 버전 9.1.2를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다. SARS-CoV-2 유사형 바이러스 패널에 대한 중화 항체 역가(NAbT)에 대한 다중 그룹 비교와 성별 및 흡연 상태에 따른 NAbs 반응 비교는 Wilcoxon 부호 순위 테스트를 사용하여 수행되었습니다. 인자 변화는 ID의 기하 평균 역가의 차이로 계산되었습니다.₅₀ Wild type pseudotyped 바이러스와 비교하여. NAbT와 연령 또는 BMI 간의 상관관계 분석은 Spearman's test를 사용하여 수행되었습니다. 감염성 통계 분석을 위해 일원 ANOVA와 Tukey의 다중 비교 검정을 수행했습니다. p 값 ≤0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

윤리적 승인

연구 프로토콜은 Universidad de Chile(프로젝트 N° 0361-2021 및 N° 096-2020) 및 Clínica Santa Maria(프로젝트 N°132604-21)의 의학부 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 모든 기증자는 사전 동의서에 서명했으며 샘플은 익명으로 처리되었습니다.

감염성 및 중화 항체 반응에 대한 람다 변이체의 스파이크 돌연변이의 영향

3695월 24일 기준으로 GISAID에 기탁된 칠레의 XNUMX개 염기서열 분석^th 2021년은 마지막 삼 분기 동안 SARS-CoV-2 변종 Gamma와 Lambda가 모든 시퀀스의 79%를 차지한다는 분명한 우세를 보여줍니다.

흥미롭게도 이 기간은 대상 인구(65.6세 이상 개인)의 18%가 27월 XNUMX일 기준으로 완전한 예방 접종 계획을 받은 대규모 예방 접종 캠페인이 특징입니다.^th 2021

완전한 계획으로 접종된 사람들의 78.2%가 Sinovac Biotech의 비활성화된 바이러스 백신 CoronaVac을 받았다는 점을 감안할 때, 우리는 이 백신에 의해 유도된 항체의 중화 능력에 대한 Lambda 변이체에 존재하는 스파이크 돌연변이의 영향을 조사하고자 했습니다.

이를 위해 우리는 우한-1 참조 계통(야생형; 계통 A), D2G 돌연변이(계통 B) 및 알파(계통 B)에서 스파이크 단백질을 운반하는 HIV-1 기반 SARS-CoV-614 유사형 바이러스를 생성했습니다. .1.1.7), 감마(계통 P.1) 및 람다(계통 C.37) 변종.

바이러스 준비 동안 우리는 Lambda 스파이크를 운반하는 유사형 바이러스에 감염된 세포가 Lambda 스파이크 단백질에 의해 유도된 증가된 감염성을 나타내는 D614G 돌연변이 또는 알파 및 감마 변이체와 비교할 때 훨씬 더 높은 생물발광 값을 생성한다는 것을 일관되게 관찰했습니다.

그림 1.다른 스파이크 단백질에 의해 매개되는 감염성.

(A) SARS-CoV-2 스파이크 단백질 및 이 연구에 사용된 변이체의 도식적 표현. 혈통은 괄호 안에 표시됩니다. RBD, 수용체 결합 도메인, CM; 세포질 꼬리.

(B) 동등한 양의 HIV-1 p24를 사용하여 각 계통의 유사형의 적정. 반딧불이 루시퍼라제 활성은 감염 후 48시간에 상대 발광 단위(RLU)로 측정되었습니다. 평균 및 SD는 대표적인 삼중 실험에서 계산되었습니다.

다음으로, 우리는 위에서 언급한 유사형 바이러스를 사용하여 칠레 산티아고의 Universidad de Chile와 Clínica Santa María의 건강한 의료 종사자로부터 얻은 79개의 혈장 샘플을 사용하여 중화 분석을 수행했습니다.

ID4 역가를 계산할 수 없었기 때문에 50개의 샘플을 제외했습니다. 분석된 샘플에서 73%가 여성에 해당했으며 중앙 연령은 34세(IQR 29~43)이고 BMI(Body Max Index)는 25(IQR 22.7~27)였습니다. 예방 접종 기간 동안 참가자의 20.5%가 활성 흡연자로 선언되었습니다. 코로나백 백신 95차 접종 후 중앙값 76일(IQR 96 – XNUMX)에 샘플을 얻었습니다.

우리는 야생형 스파이크 단백질을 운반하는 유사형 바이러스의 중화가 50% 억제 희석을 초래한다는 것을 관찰했습니다(ID₅₀) 평균 역가는 191.46(154.9 – 227.95, 95% CI,)인 반면 153.92(115.68 – 192.16, 95% CI), 124.73(86.2 – 163.2), 95, 104.57% CI ) 및 75.02(134.11 – 95, 78.75% CI) D49.8G 돌연변이 또는 알파, 감마 및 람다 변이체의 스파이크 단백질을 운반하는 유사형 바이러스에 대해 각각.

우리는 또한 ID의 기하 평균 역가가₅₀ 역가는 람다 스파이크를 보유하는 유사형 바이러스의 경우 3.05(2.57 – 3.61, 95% CI) 계수 감소, 감마 스파이크의 경우 2.33(1.95 – 2.80, 95% CI), 2.03(1.71 – 2.41, 95% CI) Wild 유형 스파이크와 비교할 때 알파 스파이크의 경우 및 D1.37G 스파이크의 경우 1.20(1.55 – 95, 614% CI)입니다.

성별, 연령, 체질량 지수(BMI) 또는 흡연 상태와 중화 항체 역가 사이의 상관 관계는 연구 코호트에서 관찰되지 않았습니다.

그림 2.CoronaVac 백신 접종자의 혈장 샘플을 사용한 중화 분석

(A) 상호 50% 중화 역가의 변화(ID₅₀) D75G(계통 B), 알파(계통 B.614)에 대한 코로나백 백신 접종자 1.1.7명의 혈장 샘플에서,

야생형 바이러스와 비교한 감마(계통 P.1) 및 람다(계통 C.37) 변이체. 결과는 일치하는 샘플의 중화 역가의 차이로 표시됩니다. ID 비교를 위한 P 값₅₀ Wilcoxon 부호 순위 검정으로 계산됩니다.

(B) 상자 그림은 ID의 중앙값 및 사분위수 범위(IQR)를 나타냅니다.₅₀ 각 유사형 바이러스에 대해. 요인 변화는 ID에서 기하 평균 역가의 차이로 표시됩니다.₅₀ Wild type pseudotyped 바이러스에 대한 것과 비교됩니다. Wilcoxon 일치 쌍 부호 있는 순위 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행했습니다.

함께, 우리의 데이터는 칠레와 남미 국가에서 많이 순환하고 있는 새로 인식된 관심 있는 람다 변이체의 스파이크 단백질이 코로나백에 의해 유도된 중화 항체로부터 벗어날 수 있는 능력과 감염성을 증가시키는 돌연변이를 가지고 있음을 보여주었습니다.